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ELISA試劑盒用途
更新時(shí)間:2016-03-21   點(diǎn)擊次數(shù):1160次

1.抗原  
ELISA試劑盒中應(yīng)用的抗原要求有較高的特異性、親和力和純度。主要有3類(lèi),即自然抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。自然抗原的純度不高,特異性不強(qiáng);合成抗原一般為多肽片段,缺乏天然抗原所具有的立體結(jié)構(gòu)表位,親和力不高,可能導(dǎo)致相應(yīng)表位的抗體漏檢;基因重組抗原具有安全、特異性強(qiáng)、親和力高、產(chǎn)量大等特點(diǎn),是一種比較理想的抗原,但其純化比較困難。 
2.抗體  
在ELISA中應(yīng)用的抗體可分為多克隆抗體(多抗)和單克隆抗體(單抗)。多抗取白免疫動(dòng)物的抗血清,制備較簡(jiǎn)單,但抗血清成分復(fù)雜,除含針對(duì)抗原(多個(gè)表位)的抗體外,還含有多種其他抗體,親和力和特異性相對(duì)要低于單抗,且制備周期長(zhǎng),批間差異較大。而單抗僅針對(duì)抗體的單一表位,親和力和特異性均較多抗高,且制備技術(shù)成熟,產(chǎn)量大,批間差異小,但結(jié)合位點(diǎn)的單一也正是其弱點(diǎn)之所在,在雙抗體夾心法中,如包被和指示抗體使用同一單抗,則由于結(jié)合位點(diǎn)的缺乏,容易造成假陰.性結(jié)果。在使用雙單抗一步法時(shí),應(yīng)注意抗原過(guò)剩時(shí)的“鉤狀效應(yīng)”
3.酶和底物  
 在
ELISA試劑盒中zui常用的酶為HRP和ALP。
(1)HRP:是一種糖蛋白,含糖量約18%,分子量為44kD,在蔬菜作物辣根中含量很高。HRP是一種復(fù)合酶,由主酶(酶蛋白)和輔基(亞鐵血紅素) 結(jié)合形成一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為五色糖蛋白,在275nm波長(zhǎng)處有zui高吸收峰;輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán),是酶的活性基團(tuán),在403nm波長(zhǎng)處有zui高吸收峰。HRP的純度用純度值(reinhartzahl,RZ)表示,RZ=A403nm/A275nm,即403nm的吸光度與280nm的吸光度之比,高純度HRP的RZ值應(yīng)≥3.0。HRP質(zhì)量的另一重要指標(biāo)是酶活力,以單位(unit,U)表示。用于標(biāo)記的HRP比活性應(yīng)≥250U/mg。HRP的作用底物為H202,催化下列反應(yīng);

DH2+H202  HRP  D+2H2O上式中DH2為供氫體(即底物),H2O2為受氫體。HRP對(duì)受氫體的專(zhuān)一性很高,除H2O2外,僅作用于小分子醇和尿素的過(guò)氧化物。HRP的底物有多種,在ELISA中常用的有:鄰苯二胺(orthophenylenediamine,OPD),四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5- tetramethyl-benzidine,TMB)和2,2,-連氮基-雙-3-乙基苯噻唑啉磺酸鹽[2,2,-azino-bisc(3- ethyl-benzthiazolinesulfonate-6),ABTS]。三者各有優(yōu)缺點(diǎn):OPD是在ELISA中應(yīng)用zui多的底物,靈敏度高,比色方便,但配成溶液后穩(wěn)定性差,且有致異變性;TMB經(jīng)酶作用后由五色變藍(lán)色,加酸終止反應(yīng)后顯,目測(cè)對(duì)比鮮明,可比色定量,溶液的穩(wěn)定性也較差,但無(wú)致異變性,因此應(yīng)用日見(jiàn)增多;ABTS雖然靈敏度不如OPD和TMB,但空白值很低。
(2)ALP:是一種磷酸酯的水解酶,用做示蹤酶的ALP活性應(yīng)在l 000U/mg以上。ALP常用的底物為對(duì)硝基苯磷酸鹽(PNP),降解產(chǎn)物為的對(duì)硝基酚。經(jīng)NaOH終止酶反應(yīng)后,顏色維持比較穩(wěn)定。
ELISA試劑盒中酶作用于底物后生成有色物質(zhì)、熒光物質(zhì)或?qū)е禄瘜W(xué)發(fā)光,分別可用分光光度計(jì)、熒光光度計(jì)測(cè)量及照度計(jì)測(cè)量。熒光和化學(xué)發(fā)光測(cè)定的敏感度均高于比色測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍亦較比色反應(yīng)寬,測(cè)定效果優(yōu)于常用的比色ELISA。

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