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ELISA檢測體系的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)
更新時間:2018-11-05   點(diǎn)擊次數(shù):1197次

    ELISA檢測體系可謂是免疫學(xué)反響應(yīng)用到科研生產(chǎn)中*為廣泛*為活絡(luò)的技術(shù)手段。但是在新老手操作過程中總是會出現(xiàn)或大或小的問題,本人在剛開始做ELISA時就面對許多困難,比如說花板,假陽性,全顯色,悉數(shù)顯色,顯色比空白還低,自己也為此苦惱過很長一段時間,跟著自己技術(shù)水平得進(jìn)步,或多或少地也把握了ELISA體系的脾氣,也是游刃有余吧,現(xiàn)在做方陣,做ELISA已是駕輕就熟了,以前檢測一種抗體用整整一下午還算得暈暈的,現(xiàn)在給我十個八個的從包被到顯色,一個作業(yè)日根本搞定。下面就由上海基免生物為你說明一下,做ELISA的經(jīng)驗(yàn)總結(jié):
    1、包被原的性質(zhì)很重要,蛋白濃度,是否降解,這到你做出的抗體可不可以被其辨認(rèn),所以保存抗原很重要,我做重組蛋白時,師兄都嚴(yán)厲警告我必定要在冰浴下緩慢消融就是這個道理。還有有的包被原可能不是蛋白,關(guān)于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)咱們要事前對其改造再加以包被,我把辦法簡要的列出如下:①親和素生物素:先親和素先包被載體,參加生物素化的DNA,這種包被辦法均勻、結(jié)實(shí),已擴(kuò)展應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。②脂類物質(zhì):可將其在有機(jī)溶劑(例如乙醇)中溶解后參加ELISA板孔中,開蓋置冰箱guo ye或涼風(fēng)吹干,待酒精揮發(fā)后,讓脂質(zhì)天然干固在固相外表。③小分子必須依托和大的蛋白載體偶聯(lián)后才干固定在固相載體上。
    2、包被液的挑選,一般挑選ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于實(shí)驗(yàn)的需要,包被原的特殊性也可能選用中性的緩沖溶液來包。應(yīng)留意以下原理:由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是經(jīng)過物理吸附結(jié)合的,靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體外表的疏水基團(tuán)間的作用,這種物理吸附對錯特異性的,受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響,大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)一般含有更多的疏水基團(tuán),故更易吸附到固相載體外表。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)還要有鞏固的理論外也要實(shí)踐,看一下*終可不可以應(yīng)用到自己實(shí)驗(yàn)當(dāng)中去。常用的包被液除了方才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液,還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
    3、顯色:顯色體系又許多,咱們一開始做的時分,要挑選適合的顯色體系。留意顯色體系酶活性底物的保存HRP結(jié)合物加硫柳泵,AP結(jié)合物可加疊氮鈉。
    4、每次做盡量要把陰陽空三個對照做好,如出現(xiàn)問題也好剖析。
    5、關(guān)閉:繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。關(guān)閉就是讓很多不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空地,從而排擠ELISA后的過程中攪擾物質(zhì)的再吸附。常用關(guān)閉劑有:0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉,可以高濃度運(yùn)用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(首要為了掃除類似蛋白攪擾)和酪蛋白等等。但*終選用什么,要根據(jù)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)來實(shí)踐。
    6、洗刷板:可以說在ELISA操作中,洗刷是*首要的關(guān)鍵技術(shù)。由于聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,為達(dá)到別離游離的和結(jié)合的酶符號物的意圖,清除殘留在板孔中游離的物質(zhì),以及非特異性地吸附的攪擾物質(zhì),在洗刷時又應(yīng)把這種非特異性吸附的攪擾物質(zhì)洗刷下來。所以在洗板時會有必定差錯,人為因素很大(當(dāng)然有條件的用洗板機(jī)在外),洗的不*或串了孔,對如此活絡(luò)的ELISA體系但是不小的影響。
    7、加抗體標(biāo)本(和二抗):留意該換槍頭時換槍頭。標(biāo)本稀釋一般可用pbs稀釋,也可用關(guān)閉液去稀釋。如需加二抗,還要留意二抗的作業(yè)濃度,太高浪費(fèi),太低則著色淺。

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